Í PCR (Polymerase keðjuverkun) tilraunir geta umbúðir virst einfaldar, en það hefur bein áhrif á stöðugleika hvarfefnis, auðvelda notkun og áreiðanlegar niðurstöður. Hvort sem það er að geyma og flytja rannsóknarstofu - Undirbúin hvarfefni eða forréttir í atvinnuskyni, getur það náð að ná réttum PCR umbúðaaðferðum við algengar villur og bæta skilvirkni tilrauna. Hér að neðan deilum við hagnýtum ráðum um efnisval, umbúðaáætlanir og geymsluupplýsingar.
I. Val umbúða: Forgangsraða eindrægni og verndun
PCR viðbrögð eru viðkvæm fyrir hitastigi, ljósi og mengun, þannig að umbúðaefni verða að uppfylla þrjár lykilkröfur: loftþéttni, ljós - sönnun og efnafræðileg óvirk.
Fyrir skilvindu rör og PCR plötur er pólýprópýlen (PP) valið, vegna mikils gegnsæis og dnase/rnase - ókeypis eiginleika . 0.2 ml þunnt - Walled PCR rör eru tilvalin fyrir skjótan hitaflutning, en 0,5 ml rör eru betri sem hentar til að geyma einbeitt svörun. Fyrir 96 - vel PCR plötur, mælum við með að velja pilsaða hönnun (til að auðvelda vélfærafræði) eða hönnun sem ekki er með pilt (fyrir geimvernd).
Þéttingaraðferð: Hefðbundin skilvindu rör nota flatar eða hækkaðar húfur (til að koma í veg fyrir uppgufun og þurrkun). Hins vegar er mælt með langa - geymslu geymslu, hita - innsiglingarfilmu (eins og parafilm) eða anda filmu (svo sem loft) til að halda jafnvægi á innri og ytri þrýstingi. Mælt er með PCR plötum til að nota lím á álþynnum (hátt - hitastigi) eða sjálf - límfilmu (fyrir stakan - notkun).
Ljósvörn: Hvarfefni sem innihalda ljós - viðkvæm innihaldsefni (svo sem ákveðin litarefni eða grunnur) ættu að vera vafin í álpappír, eða nota skal svartar PCR plötur (fáanlegar frá sumum framleiðendum).
II. Tækni til að lágmarka tap frá endurteknum frysti - þíðingarferli
Stiquoting hvarfefni er kjarnaskref í PCR umbúðum og hefur bein áhrif á æxlun tilrauna.
Mælt er með Master Mixoting: Mælt er með viðskiptameistara (svo sem TAQ ensím og DNTP blöndu) út frá hvarfrúmmálinu auk 5% - 10% framlegð (td fyrir 20 μl viðbrögð, Aliquot 22 μl á per rör). Forðastu að nota beint frá magnum umbúðum, þar sem endurteknar frysta - þíðingarferlar geta leitt til minnkaðrar ensímvirkni (Taq ensím getur tapað um það bil 5% virkni á frystihjalinni).
Mælt er með grunnur og sniðmát: Grunur (sérstaklega sérsniðnir grunnar) eru mælt með skipt úr 100 μm lager lausnum og geymdir við - 20 gráðu. Þynntu í vinnustyrk (venjulega 0,1–1 μM) fyrir notkun. Sniðmát eins og erfðafræðilegt DNA ætti að vera deilt í stakri - notaðu magn til að forðast krossmengun.
Ábendingar um forvarnir gegn mengun: Gakktu úr skugga um að skilvindu rör séu þurr áður en samningur (leifar etanól getur hindrað PCR), fyrir - kaldar pípettuábendingar til að koma í veg fyrir að kalt hvarfefni festist við vegginn og klæðist hanska um allt ferlið til að forðast DNA mengun húðar.
Iii. Merkingar og plötusnúðar: Forðastu gildruna „Black Box“
Skýr merking skiptir sköpum fyrir PCR umbúðir; Röng merking getur eyðilagt alla tilraunina.
Lögboðnar upplýsingar um merkingar: Nafn hvarfefna (td „2 × Taq MasterMix“), styrkur/innihald (td, „10 mm DNTPS“), lotufjöldi (fyrir rekjanleika), geymsluaðstæður (td, „-20 gráðu verndað fyrir ljós“), skammtímadag og gildistíma (td, „Notaðu innan 6 mánaða“).
Sérstök merking: Ef hvarfefnið inniheldur glýseról (frostlegi), litarefni (td SYBR Green) eða aukefni (td BSA), verður að veita viðbótarupplýsingar (td, "inniheldur 50% glýseról, ekki geyma við háan hita").
Taktu samstillingu: Mælt er með því að nota töflureikni eða rannsóknarstofustjórnunarhugbúnað (td LabGuru) til að skrá nákvæmar breytur innihalds hvers rörs (td grunnröð, TM gildi) og tengja þær við líkamlega merkimiða.
IV. Geymsla og flutningur: Jafnvægishitastig og líkamleg vernd
Stöðugleiki PCR hvarfefna er mjög háður geymsluaðstæðum og viðbótarvernd er nauðsynleg við flutning.
Almenn geymsla:
Ensím (Taq, Reverse Transcriptase): Long - hugtakageymsla við - 20 gráðu (forðast endurteknar frysti -þíðingarlotur; deilur og geymdu við -80 gráðu til framtíðar notkunar);
Grunnur/rannsakar: Geymið með -20 gráðu í meira en 1 ár (ef þú inniheldur breyttan hóp eins og biotin, vernd gegn ljósi);
Non - ensím stuðpúðar (td, pbs): stutt - geymsla með 4 gráðu (allt að 1 mánuð).
Kröfur um flutninga:
Notaðu þurrís fyrir kalda keðju (- 78 gráðu) fyrir ensím (viðhaldið undir -20 gráðu) og bláum ís (um 0 gráðu) fyrir stuðpúða til skammtímaflutninga.
Forðastu óhóflegan titring (PCR plötur ættu að vera festar í froðukassa til að koma í veg fyrir blöndun hvarfefna milli holna).
Bætið einangrunarlagi við umbúðirnar við háan sumarhitastig (td álpappír einangrunarpoki + frosinn hlauppakki).
V. Algeng vandamál og lausnir
Vandamál 1: Úrkoma hvarfefna (td DNTPS eða MGCL₂ Úrkoma við lágt hitastig) → Lausn: Stutt skilvindu (1000 snúninga á mínútu, 1 mínúta) áður en samningur var búinn. Leysið upp í 37 gráðu útungunarvél fyrir notkun og hvirfil til að blandast vandlega.
Vandamál 2: Plataþéttiefni flýtir auðveldlega af → Lausn: Veldu HEAT - ónæmt innsigli með límmiði, eða notaðu hitasiglingu (hentugur fyrir hátt - afköstartilraunir).
Vandamál 3: óskýr merki → Lausn: Notaðu vatnsheldur merki (eins og Sharpie) eða leysir - prentmerki til að koma í veg fyrir að rithönd verði eytt af áfengi.
Niðurstaða
PCR umbúðir eru meira en bara „umbúðir“ hvarfefni; Það er fyrsta varnarlínan fyrir tilraunaáreiðanleika. Með því að velja viðeigandi efni, staðla skammtímaferlið, viðhalda ítarlegri merkingu og viðhalda ströngu hitastýringu meðan á flutningi stendur, getur þú dregið verulega úr mannlegum mistökum, tryggt stöðugri síðari magnunarviðbrögð og áreiðanlegri niðurstöður. Mundu: Upplýsingar ákvarða árangur. Rétt PCR umbúðaaðferðir geta sparað verulegan tíma úrræðaleit í allri tilrauninni!